
- 2025-01-10 10:50:43原位紅外光譜
- 原位紅外光譜是一種在樣品反應過程中實時監(jiān)測其紅外光譜變化的技術。它利用紅外光與物質分子的相互作用,獲取分子振動、轉動等信息,從而揭示物質的結構和組成。該技術廣泛應用于催化、材料科學、藥物合成等領域,可原位監(jiān)測反應進程、催化劑活性及穩(wěn)定性等,對理解反應機理、優(yōu)化反應條件具有重要意義。
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原位紅外光譜問答
- 2018-12-04 15:19:39用原位紅外光譜是檢測不到金屬表面信號的么
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- 2022-12-06 13:04:21探秘腫瘤微環(huán)境,原位“看透”細胞因子
- 細胞因子是腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment,TME)中細胞通訊的關鍵介質,在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、治 療和預后等多個方面發(fā)揮重要作用。在過去的 40 年中,細胞因子和細胞因子受體作為癌癥靶點或癌癥治 療方法得到了廣泛的研究。目前公認的臨床前治 療策略為增強干擾素和白細胞介素(包括 IL-2 ,IL-7 ,IL-12 和 IL-15 )的生長抑 制和免疫刺激作用,或抑 制細胞因子(如 TNF ,IL-1β 和 IL-6 )的炎癥和促進腫瘤的作用[1]。圖 1 . 細胞因子在腫瘤微環(huán)境中的作用特定細胞因子的表達也與腫瘤細胞的高存活率和高轉移性密切相關。其中促炎細胞因子 IL-6 和 IL-8 與多種癌癥相關,包括淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結腸直腸癌等 [2,3]。因此,分析細胞因子的表達是一種重要的診斷工具和預測癌癥預后的關鍵因素。非放射性的 RNA 原位雜交技術(ViewRNA ISH)是一種高靈敏度的檢測細胞因子表達的有效方法,并且可以對 1 至 4 個 mRNA 目標進行多重分析。檢測原理如下圖所示:圖 2 . ViewRNA ISH 檢測原理安捷倫BioTek Cytation 5 多功能細胞成像微孔板檢測系統(tǒng),可容納多達四個熒光通道同時成像,快速并出色地成多色熒光成像。儀器配備的高內涵分析軟件可自動計算細胞內 RNA 的表達水平。Cytation 5 活細胞成像工作站結合ViewRNA ISH,為細胞因子研究提供了一種高效率、高靈敏度和可重復的檢測方法。實驗案例分享 實驗一.細胞因子mRNA的成像和分析 為研究細胞因子mRNA 在不同營養(yǎng)條件下的表達情況,設置兩組對照實驗。陽性對照細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中,而陰性對照細胞經(jīng)過 18 小時的血清饑餓處理。隨后加入 ViewRNA 探針以標記 IL-6 、IL-8 和 ACTB mRNA ,在Cytation 5 上分別使用 RFP 、GFP 、Cy5 和 DAPI 通道對探針進行成像完成 ISH 細胞分析。圖像結果表明:細胞因子mRNA 的表達在營養(yǎng)匱乏的條件下會顯著降低。圖 3 . 陽性和陰性對照組成像。HCT116 放大 20 倍圖像作為( A )陽性對照和( B )陰性對照。MDA-MB-231 細胞放大 40 倍的圖像作為( C )陽性對照和( D )陰性對照。藍色:DAPI 染色的細胞核;綠色:標記 IL-8 mRNA ;橙色:標記 IL-6 mRNA ;紅色:標記 ACTB mRNA 。接下來為了定量分析細胞因子表達,首先在 Cytation 5 的 DAPI 通道下進行細胞核計數(shù),以確定每孔的細胞數(shù)量(圖 4A )。然后分別在GFP 、RFP 通道進行細胞因子探針( IL-6 或 IL-8 )的熒光信號分析(圖 4B )。通過細胞熒光信號的比率評估不同實驗條件下的細胞因子表達(圖 5 )。圖 4 . 每個細胞的熒光信號分析。( A ) 使用 Agilent-BioTek Gen5 軟件進行細胞分析圈選出 DAPI 標記的細胞核;( B ) 熒光標記的 IL-8 信號的圖像分析。如圖 5 所示,使用 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合準確的量化了細胞內 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。圖 5 . MDA-MB-231 細胞中 IL-8 表達和 HCT116 細胞中 IL-6 表達,并以細胞數(shù)目進行校正。 實驗二.誘導細胞因子 mRNA 的表達 使用不同劑量的 IL-1β 刺激 DU145 細胞,以分析細胞因子的 mRNA 的表達(圖6)。圖 7 結果顯示:雖然 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 表達增加,但 IL-8 的表達變化更為顯著,這與先前研究結果一致[4]。IL-1β 的最 高劑量下,這兩種細胞因子的表達減少則是由于細胞毒性。這驗證了該檢測方法的可行性與穩(wěn)定性。圖 6 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下的 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號 ( A ) 0 ng/mL;( B ) 0.02 ng/mL ;0.128 ng/mL;( D ) 0.8 ng/mL。藍色:DAPI染色的細胞核;綠色:標記的IL-8 mRNA;橙色:標記的 IL-6 mRNA ;紅色:標記的 ACTB mRNA 。圖 7 . 不同濃度的 IL-1β 刺激下 DU145 細胞中 IL-6 和 IL-8 mRNA 的表達。 實驗三.抑 制細胞因子 mRNA 的表達 研究表明絲裂原活化蛋白激酶( MAPK )可調節(jié) IL-8 ,并證明用 MAPK/ERK 抑 制劑 U 0126 治 療可減少 DU145 和 MDA-MB-231 細胞中的炎癥細胞因子[4,5]。為了確認這一現(xiàn)象并驗證 ViewRNA ISH 和 Cytation 5 這一組合的能力,將不同濃度的 U 0126 加入到每種細胞類型中孵育 30 分鐘。然后用 1 ng/mL 的 IL-1β 刺激 DU145 細胞達 3 小時,而 MDA-MB-231 細胞未被刺激。使用 GFP 和 RFP 通道進行細胞計數(shù)和圖像分析以評估在 U 0126 治 療后 IL-8 和 IL-6 細胞因子 mRNA 的表達。采集的圖像(圖 8 )和計算的熒光信號強度 (圖 9 )證實了 U 0126 的抑 制作用。此外,也驗證了該方法的靈敏度,可以準確識別給予抑 制劑后 mRNA 的表達變化。圖 8. U 0126 抑 制 IL-8 mRNA 的表達。圖像顯示了在不同濃度的 U 0126 處理后 ( A-E ) MDA-MB-231 細胞內 IL-6 、IL-8 和 ACTB 熒光 mRNA 探針信號;( F-J ) 為 DU145 細胞。藍色:DAPI 染色的細胞核;綠色:標記的 IL-8 mRNA ;橙色:標記的 IL-6 mRNA ;紅色:標記的 ACTB mRNA 。圖 9 . U 0126 治療后 IL-8 和 IL-6 mRNA 在 MDA-MB-231 和 DU 145 細胞中的表達結 語ThermoFisher 的 ViewRNA ISH 細胞分析試劑盒和探針提供一種靈敏的方法來檢測 mRNA 表達。該方法在安捷倫BioTek Cytation 5 細胞成像系統(tǒng)的加持下得以更更快地采集多熒光通道的圖像,并更精 準的計算出每一個細胞的熒光信號強度。這種檢測、成像和分析的完 美結合提供了一種靈敏、靈活和高通量的方法用以檢測細胞因子 mRNA 的表達。參考文獻:[1] Propper DJ, Balkwill FR. Harnessing cytokines and chemokines for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Apr;19(4):237-253.[2] Kampan NC, Xiang SD, McNally OM, Stephens AN, Quinn MA, Plebanski M. Immunotherapeutic Interleukin-6 or Interleukin-6 Receptor Blockade in Cancer: Challenges and Opportunities. Curr Med Chem. 2018;25(36):4785-4806.[3] Vecchi L, Mota STS, Zóia MAP, Martins IC, de Souza JB, Santos TG, Beserra AO, de Andrade VP, Goulart LR, Araújo TG. Interleukin-6 Signaling in Triple Negative Breast Cancer Cells Elicits the Annexin A1/Formyl Peptide Receptor 1 Axis and Affects the Tumor Microenvironment. Cells. 2022 May 20;11(10):1705.[4] Kooijman R, Himpe E, Potikanond S, Coppens A. Regulation of interleukin-8 expression in human prostate cancer cells by insulin-like growth factor-I and inflammatory cytokines. Growth Horm IGF Res. 2007 Oct;17(5):383-91.[5] Chelouche-Lev D, Miller CP, Tellez C, Ruiz M, Bar-Eli M, Price JE. Different signalling pathways regulate VEGF and IL-8 expression in breast cancer: implications for therapy. Eur J Cancer. 2004 Nov;40(16):2509-18.
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- 2024-03-05 17:21:07近紅外光譜解析實用指南
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