Mitochondria Isolation Kit for Cell and Tissue 組織/細(xì)胞線粒體分離試劑盒

產(chǎn)品描述

線粒體是絕大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的一種基本的重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞的動力工廠，細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的場所。因此，對線粒體進(jìn)行分離，以此為對象，對線粒體呼吸作用、mtDNA、mtRNA以及其他線粒體蛋白性能分析等具有重要意義。

本試劑盒可用于快速便捷分離組織/細(xì)胞線粒體，獲得的線粒體純度較高，且絕大部分都含有完整的內(nèi)膜和外膜，可用于線粒體的生理功能等方面的研究，得到的線粒體也可被相應(yīng)裂解液裂解得到線粒體蛋白，從而用于后續(xù)SDS-PAGE、Western、雙向電泳及免疫共沉淀等分析。

按照每個樣品使用量（細(xì)胞1-5×107個；組織：100-200 mg），20128ES50/20128ES60可分別進(jìn)行50個和100個樣品的抽提。

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產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。臺盼藍(lán)染色液可4℃保存。

注意事項

1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

一、線粒體的抽提

1. 樣本處理
1）組織勻漿：稱取100-200 mg新鮮組織，預(yù)冷的PBS或生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，用剪刀剪成非常小的碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1-2.5 mL冰預(yù)冷的試劑A，混勻，孵育8-10 min，勻漿10-30下左右，也可采用超聲方法破膜。
2）培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800 g，4℃ 離心5-10 min收集細(xì)胞。計數(shù)，每次提取需要1-5×107個細(xì)胞，加入1-2.5 mL預(yù)冷的試劑A，重懸細(xì)胞，混勻，冰上孵育10-15 min，可以采用超聲或勻漿器方法破膜。
注：觀察細(xì)胞膜破碎情況，可取少量細(xì)胞液，與臺盼藍(lán)染色液按照1:1比例混合后，鏡檢。當(dāng)大多數(shù)（≥80%）細(xì)胞為藍(lán)色，可進(jìn)行下面實驗。

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4ºC，1000 g離心10 min。【注】：細(xì)胞核、大的膜碎片、未裂解細(xì)胞等沉淀在管底。 

3. 收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。4ºC，1000 g 再次離心5 min。棄沉淀。
4. 將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。4ºC，12,000 g離心10 min，小心去除上清，沉淀即為分離得到的細(xì)胞線粒體。
注：離心后的上清含胞漿成分，盡量除去上清。

二、線粒體蛋白的抽提

1. 向每毫升預(yù)冷試劑B加入10 μL試劑C混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2. 按每10 μL線粒體壓積中，加入100 μL上述配制好的試劑B/C溶液。

3. 置于4℃ 15-30 min，間斷渦旋振蕩。

4. 10,000 rpm，4℃離心15 min，取上清，即為線粒體全蛋白提取物，進(jìn)行蛋白定量。

5. 分裝保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。

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