miRNA的定量分析，這里有方案！

2023-09-22 00:00:00 18閱讀次數

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MicroRNAs（miRNAs）是一種大小約21-28個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。miRNA主要與靶基因mRNA3‘端非編碼區(qū)域特異性結合，調控轉錄后靶基因mRNA的翻譯過程，從而阻斷mRNA翻譯和促進mRNA降解導致蛋白質表達降低。miRNA的作用涉及個體發(fā)育、組織分化、細胞增殖和細胞凋亡等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。

圖.miRNA體內合成示意

miRNA研究的關鍵是如何準確且特異性地檢測分析miRNA。目前檢測分析miRNA的方法中最為常用的是熒光定量PCR。但是miRNA本身相對較小，傳統的RNA提取、反轉錄和定量方法難以高效的保證miRNA的檢測，選對適配的方法此時則顯得尤為重要。

傳統的有機提取通常提取的是較大分子量的RNA，例如mRNA和核糖體RNA，但對于miRNA的提取效果則不太理想，可能是由于小分子量的miRNA不易被醇類沉淀。針對這個問題，翌圣匠心研發(fā)了專門針對miRNA提取的產品-MolPure^® Cell/Tissue miRNA Kit 細胞/組織miRNA提取試劑盒。

miRNA提取產品推薦

19331ES-MolPure^® Cell/Tissue miRNA Kit 細胞/組織miRNA提取試劑盒

產品性能

快速，簡捷，可在30分鐘內完成miRNA提取
不用乙醇沉淀，減少小分子RNA丟失

成熟的miRNA的長度只有20nt左右，通常正向引物就會覆蓋其全長甚至會有多余部分，反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉錄時設法增加反轉錄產物長度。常見的方法有加尾法和莖環(huán)法。

加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉錄引物，合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈。莖環(huán)法以折疊為莖環(huán)結構的通用序列作為引物合成加長的miRNA對應cDNA第一鏈，后續(xù)擴增過程中，莖環(huán)結構在適宜的溫度下會被打開，和相關擴增引物結合。

圖. 加尾法合成miRNA

圖.莖環(huán)法合成miRNA

反轉定量產品推薦

翌圣miRNA加尾法反轉定量組合（11148ES&11171ES)

11148ES-Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

試劑盒采用加尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉錄，產品中的2×Hifair^® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應和反轉錄反應的所有原料和引物，并經過精心優(yōu)化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉錄過程同時高效進行。

11171ES -Hieff^®miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

專門為miRNA定量檢測而研發(fā)的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA 聚合酶采用化學修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內進行準確定量。

產品性能

可兼容全平臺qPCR儀器

以293T細胞的Total RNA為模板，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內參基因。

檢出率高，最高可達10 pg

以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度：60拷貝到60⁶拷貝（6個梯度）和10 pg-100 ng(5個梯度)，用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達情況。

高特異性，能區(qū)分同家族miRNA間單堿基差異

人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴增這些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%計算匹配率。結果顯示，可有效區(qū)分密切相關的亞型家族成員。

擴增效率出色

以人293T細胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結果顯示，與同類產品相比，Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff^®miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應體系，具有優(yōu)異的表現。

穩(wěn)定性優(yōu)秀，在 37℃穩(wěn)定7天或凍融50次或配置體系在25℃保留48 h，效果依舊穩(wěn)定

以293T細胞Total RNA為模板用Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋10倍，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表達情況?！鰿t<0.5。

翌圣miRNA莖環(huán)法反轉定量組合（11139ES&11170ES)

11139ES-Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

該試劑盒基于Hifair^® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的反轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉錄。Hifair^® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達19.8 kb的cDNA。

11170ES-Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

本產品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA定量反應的專用預混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時對特異性要求極高。本品基于熱啟動的 DNA 聚合酶，配以優(yōu)化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴增；同時，特殊的ROX Reference Dye，使得預混液適應于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。

可兼容全平臺qPCR儀器

以小鼠肝臟細胞的Total RNA為模板，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋40倍后，用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴增人源的mmu-miR-125a基因。

靈敏度高，可達10 pg

以小鼠肝臟細胞的Total RNA為模板，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA 以10倍梯度稀釋（范圍10pg /μL-0.1μg /μL），擴增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

高特異性，能區(qū)分同家族miRNA間單堿基差異

人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。以不同的引物，使用 Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分別擴增這些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%計算匹配率。

重復性好

以人293T細胞的Total RNA為模板反轉錄，用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋50倍，使用Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）進行90孔平行重復實驗擴增人源的hsa-let-7a基因。

穩(wěn)定性好，37℃穩(wěn)定14天或凍融穩(wěn)定50次或配置體系在25℃保留24h后，效果依舊穩(wěn)定

以小鼠肝臟細胞的Total RNA為模板用Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋100倍，擴增鼠源的mmu-miR-132基因。

相關產品列表

方法類型	實驗步驟	產品名稱	產品貨號
miRNA提取	核酸提取	MolPure^® Cell/Tissue miRNA Kit	19331ES
miRNA提取	核酸提取	MolPure^® Serum/Plasma miRNA Kit	19332ES
加尾法反轉定量	反轉錄	Hifair^® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit	11148ES
加尾法反轉定量	定量PCR	Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix	11171ES
莖環(huán)法反轉定量	反轉錄	Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)	11139ES
莖環(huán)法反轉定量	定量PCR	Hieff^® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix	11170ES