線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

YIJI線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI線粒體呼吸鏈復(fù)合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚，通過(guò)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定樣品中二氯酚靛酚還原后吸光峰值的變化，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于其適合于各種純化線粒體樣品（動(dòng)物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測(cè)?？捎糜谒ダ稀⒛芰看x、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

線粒體呼吸鏈復(fù)合物II，通常稱為琥珀酸－輔酶Q還原酶或琥珀酸脫氫酶（Succinate-CoenzymeQReductase；SuccinateDehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈與三羧酸循環(huán)鏈接的載體：含有四個(gè)亞單位，包括共價(jià)結(jié)合的輔基黃素腺嘌呤二核苷酸（flavinadeninedinucleotide；FAD）和三個(gè)鐵硫ZX（Fe-Sclusters），以及細(xì)胞色素b亞單位，其Z特征性的酶活性是丙二酸鈉敏感的琥珀酸－輔酶Q還原酶。復(fù)合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化為富馬酸（fumarate），線粒體內(nèi)電子由供體FAD傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)行呼吸鏈傳遞。該酶異常會(huì)導(dǎo)致嗜鉻細(xì)胞瘤（paraganglioma）、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（pheochromocytoma）和Leigh綜合征?；阽晁岬孜?，通過(guò)琥珀酸－輔酶Q還原酶的催化，氧化為富馬酸，同時(shí)氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）轉(zhuǎn)化為還原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化（600nm波長(zhǎng)），由此定量測(cè)定琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（ReagentA） 毫升

YIJI反應(yīng)液（ReagentB） 毫升

YIJI陰性液（ReagentC） 毫升

YIJI底物液（ReagentD） 微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI反應(yīng)液（ReagentB）和YIJI底物液（ReagentD），避免光照，有效保證6月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI緩沖液（ReagentA）室溫預(yù)熱；YIJI反應(yīng)液（ReagentB）和YIJI底物液（ReagentD）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、測(cè)定準(zhǔn)備

1．準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里

2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為600nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

二、背景對(duì)照測(cè)定

1．移取xx微升YIJI緩沖液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升YIJI反應(yīng)液（ReagentB）

3．加入xx微升YIJI底物液（ReagentD）

4．上下傾倒數(shù)次，混勻

5．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入xx微升YIJI陰性液（ReagentC）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：600波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘－600波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘

三、樣品活性測(cè)定

1．移取xx微升YIJI緩沖液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升YIJI反應(yīng)液（ReagentB）

3．加入xx微升YIJI底物液（ReagentD）

4．上下傾倒數(shù)次，混勻

5．放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6．加入100微升待測(cè)樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）

7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8．即刻放入分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：600波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘－600波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘

四、計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

1．本產(chǎn)品為21次操作，包括背景對(duì)照

2．操作時(shí)，須戴手套

3．YIJI反應(yīng)液（ReagentB）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸

4．系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

5．線粒體樣品檢測(cè)前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3次

6．如果增強(qiáng)酶活檢測(cè)，建議使用YIJI線粒體復(fù)合物待測(cè)樣品預(yù)處理試劑盒－GMS10342

7．加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測(cè)定

8．96孔板測(cè)定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.5左右為理想狀態(tài)；比色皿測(cè)定為1.0左右

9．反應(yīng)1分鐘后比色測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù)5分鐘

10．測(cè)定值由高到低變化，即5分鐘測(cè)定讀數(shù)低于0分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性

11．比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

12．建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供YIJI線粒體溶解試劑盒GMS10018為后續(xù)的線粒體蛋白濃度測(cè)定的預(yù)處理試劑盒和YIJIBradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

13．如果使用細(xì)胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升

14．線粒體呼吸鏈復(fù)合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

15．本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

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