硅烷偶聯(lián)劑與高嶺土作用機(jī)理？

胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是由多基因編碼、具有多種功能的超家族酶，GST廣泛存在于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和植物體內(nèi)的一種解-毒系統(tǒng)中，其專一性催化還原型的谷胱甘肽巰基與其他化合物的親電基團(tuán)，生成谷胱甘肽衍生物，具有降低化學(xué)反應(yīng)活性的效應(yīng)。在各種生物體內(nèi)，GSTs是由多個(gè)基因編碼的、具有多種功能的一組同工酶，分子量為23∽29kDa，由200∽240個(gè)氨基酸組成。有膜結(jié)合和胞液兩種形式，以胞液GSTs為主。根據(jù)蛋白酶的一級序列、免疫原性、酶動(dòng)力學(xué)和三、四級結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，GST又可以分為多個(gè)亞類。

GST標(biāo)簽作用機(jī)理

1）應(yīng)用于原核表達(dá)，作為一種高度可溶的蛋白，能增加外源蛋白的可溶性，在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用；

2）GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性；

3）GST在變性條件下會(huì)失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑（如：鹽酸胍或尿素等）；

4）GST融合蛋白已經(jīng)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的基本工具，其廣泛用于研究蛋白質(zhì)-DNA及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，也可作為抗原用于免疫學(xué)或疫苗的研究。

5）GST標(biāo)簽的切除：①凝血酶：一種應(yīng)用很廣泛的蛋白酶，主要特點(diǎn)是經(jīng)凝血酶切割后的重組蛋白在切割位點(diǎn)的C端會(huì)保留兩個(gè)氨基酸殘基。凝血酶可以識別兩種類型的氨基酸序列，分別為X4-X3-P-P[K]-X1?-X2?和X2-R[K]-X1?，凝血酶對前一種序列的識別效果更為理想。②Xa因子：Xa因子是一種較高效的去除融合標(biāo)簽的工具酶，可特異性識別I-E[D]-G-R-X1序列，并將融合標(biāo)簽從其C末端切除。

GST標(biāo)簽純化蛋白的優(yōu)劣勢：

優(yōu)勢：

1. 適用范圍廣，可在不同宿主中表達(dá)；

2. 增強(qiáng)外源蛋白可溶性；

3. 可用不同的蛋白酶進(jìn)行去除；

4.   有助于保持蛋白的抗原性與生物活性，提高外源蛋白的穩(wěn)定性；

5.   特異性好，純化方便且溫和。

劣勢：

1.   分子量較大，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和下游實(shí)驗(yàn)；

2.   僅能純化可溶性蛋白，若蛋白不可溶，則很難用變性的方法純化。

GST標(biāo)簽純化蛋白常見問題解析：

問題一：GST 融合蛋白的產(chǎn)量低或無法檢測到

1、原因：融合蛋白形成包涵體

解決方案：

①采用低溫（16∽25℃）培養(yǎng)細(xì)胞，或者誘導(dǎo)過程中降低誘導(dǎo)劑的終濃度至1mM，或者縮短誘導(dǎo)時(shí)間。

②純化前需要完全融解和復(fù)性。將裂解液與GST標(biāo)簽蛋白純化瓊脂糖凝膠在搖床上輕搖2個(gè)小時(shí)或者更長時(shí)間（過夜），充分結(jié)合后上柱純化。

2、原因：融合蛋白可能失活

解決方案：采用溫和的超聲破碎條件或者其他的裂解條件，比如采用溶菌酶。

3、原因：融合蛋白被蛋白酶降解

解決方案：在裂解步驟或洗滌步驟加入適量的蛋白酶抑-制劑，如PMSF。

4、原因：融合蛋白不能有效地從樹脂上洗脫下來

解決方案：

①延長洗脫時(shí)間，或者增加洗脫液中還原性谷胱甘肽的濃度至15mM或者更高調(diào)節(jié)洗脫液的pH值至8.0∽9.0。

②在洗脫液中加入Triton X-100（終濃度0.1%）、辛基-葡萄糖苷（終濃度2%）或者NaCl（終濃度0.1∽0.2 M）。

問題二：洗脫液中有較多雜帶

1、原因：融合蛋白被蛋白酶降解

解決方案：在裂解步驟或洗滌步驟加入適量的蛋白酶抑-制劑如PMSF。

2、原因：一些宿主蛋白，比如伴侶蛋白，可能會(huì)和融合蛋白互相作用

解決方案：

在洗滌液中加入DTT（終濃度5 mM）。在純化前將重組蛋白溶液和伴侶蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM   Tris-HCl)，37℃振蕩10 min

3、原因：過度的超聲處理會(huì)導(dǎo)致一些蛋白與融合蛋白相結(jié)合

解決方案：采用溫和的超聲破碎條件或者其他的裂解條件。

4、原因：有些蛋白會(huì)與融合蛋白或樹脂發(fā)生非特異性結(jié)合

解決方案：優(yōu)化洗滌條件：加入一些洗滌劑如1%   Triton X-100、1%Tween-20、0.03%   SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特異性吸附。優(yōu)化洗滌液中的鹽濃度也可以降低非特異性吸附。

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