EPR課堂 | 電子-電子雙共振技術(shù)在DNA結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用

自20世紀(jì)50年代，Watson和Crick提出經(jīng)典的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來(lái)，DNA就成為了生命科學(xué)研究的核心。DNA中4種堿基的數(shù)目及其排列順序會(huì)導(dǎo)致基因的多樣性，其空間結(jié)構(gòu)也會(huì)影響著基因的表達(dá)。

圖片來(lái)源：攝圖網(wǎng)

除了傳統(tǒng)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中還存在著一種特殊的四鏈DNA結(jié)構(gòu)——G-四鏈體。G-四鏈體（G-quadruplex）是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥(niǎo)嘌呤（G）的DNA或RNA折疊形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)，在迅速分裂的細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）中G-四鏈體的含量特別高。因此，G-四鏈體可作為抗 癌研究中的藥物靶點(diǎn)。研究G-四鏈體的結(jié)構(gòu)及其與結(jié)合劑的結(jié)合模式，對(duì)于癌細(xì)胞的診斷與治療具有重要的意義。

G-四鏈體的三維結(jié)構(gòu)示意圖。圖片來(lái)源：wikipedia

電子-電子雙共振技術(shù)

脈沖偶極電子順磁共振（Pulsed Dipolar EPR，PDEPR）方法已經(jīng)發(fā)展成為結(jié)構(gòu)和化學(xué)生物學(xué)中可靠和通用的結(jié)構(gòu)測(cè)定工具，通過(guò)PDEPR技術(shù)可在納米尺度上提供距離信息。在G-四鏈體結(jié)構(gòu)研究中，使用電子-電子雙共振（electron-electron double resonance，DEER）技術(shù)結(jié)合定點(diǎn)標(biāo)記（site-directed spin labeling，SDSL）技術(shù)可區(qū)分不同長(zhǎng)度的G-四鏈體二聚體并揭示G-四鏈體結(jié)合劑與二聚體的結(jié)合模式。

利用DEER技術(shù)區(qū)分不同長(zhǎng)度的G-四鏈體二聚體

使用Cu(pyridine)4作為距離測(cè)量的自旋標(biāo)記，將四方平面Cu(pyridine)4復(fù)合物與G-四鏈體共價(jià)結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)偶極-偶極相互作用測(cè)量π-堆疊的G四元單體中兩個(gè)順磁Cu2+之間的距離，從而研究二聚體的形成。

[Cu2+@A4]（TTLGGG）與[Cu2+@B4]（TLGGGG）為兩種具有不同序列的寡核苷酸，其中，L表示配體。圖1和圖2為[Cu2+@A4]2和[Cu2+@B4]2的DEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從DEER結(jié)果中可得到[Cu2+@A4]2二聚體中，單個(gè)Cu2+ -Cu2+的平均距離dA=2.55 nm，G-四鏈體3′端通過(guò)尾尾疊加形成G-四鏈體二聚體，且G-四鏈體二聚體中兩個(gè)Cu2+自旋標(biāo)簽的gz軸平行排列。

與[Cu2+@A4]2二聚體相比，[Cu2+@B4]2  π堆積距離比 [Cu2+@A4]2二聚體長(zhǎng)（dB-dA = 0.66 nm），證實(shí)了每個(gè)[Cu2+@B4]單體含有一個(gè)額外的G四分體，這個(gè)結(jié)果與預(yù)期距離完全一致。因此，通過(guò)DEER技術(shù)進(jìn)行距離測(cè)量，可區(qū)分不同長(zhǎng)度的G-四鏈體二聚體。

圖1 (A) [Cu2+@A4]2二聚體的脈沖EPR微分譜(黑線)及其對(duì)應(yīng)的模擬(紅線) (34 GHz，19 K); (B)背景校正后在a-d四個(gè)場(chǎng)位置的DEER時(shí)域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的最佳擬合結(jié)果(紅線); (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布; (D) [Cu2+@A4]單體和[Cu2+@A4]2二聚體之間的平衡。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

圖2 (A)[Cu2+@B4]2背景校正后在a-d四個(gè)場(chǎng)位置的DEER時(shí)域圖(黑線)及從PeldorFit獲得的最佳擬合結(jié)果(紅線); (B)[Cu2+@B4]的結(jié)構(gòu)示意圖; (C)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的距離分布。(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

利用DEER技術(shù)探究G-四鏈體結(jié)合劑與二聚體的結(jié)合模式

許多小分子和金屬配合物，具有平面芳香大共軛體系且?guī)д姾?，可以結(jié)合并穩(wěn)定折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而成為潛在的抗 癌藥物。

N,N ' -雙[2-(1-哌啶基)乙基]3,4,9,10-苝四羧基二酰鹽酸鹽（PIPER）就是一種著名的G-四鏈體結(jié)合劑，可通過(guò)堆積作用與四鏈體結(jié)合并穩(wěn)定四鏈體，通過(guò)DEER技術(shù)可探究PIPER與G-四鏈體的結(jié)合模式。

圖3與圖4為不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為1：1時(shí)（PIPER@[Cu2+@A4]2），dP = 2.82 nm。

與純[Cu2+@A4]2二聚體（dA = 2.55 nm）相比，Cu2+-Cu2+之間距離增大，說(shuō)明了PIPER與二聚體形成了三明治復(fù)合物，平面有機(jī)分子插在兩個(gè)G四聯(lián)單體的3′面之間。當(dāng)PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例為2：1時(shí)（2PIPER@[Cu2+@A4]2），d2P = 3.21 nm。

與PIPER@[Cu2+@A4]2二聚體（dP = 2.82 nm）相比，多了一個(gè)π堆積的距離，說(shuō)明兩個(gè)PIPER配體插入到尾對(duì)尾排列的G四鏈二聚體中。通過(guò)DEER技術(shù)可揭示G -四鏈體結(jié)合劑PIPER插入G-四鏈體二聚體中形成夾層復(fù)合物的新結(jié)合模式。

圖3 (A)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER偶極譜(geff =2.061); (B)含有不同PIPER與[Cu2+@A4]2二聚體比例的DEER調(diào)制深度;(C)[Cu2+@A4]2二聚體和PIPER@[Cu2+@A4]2、2PIPER@[Cu2+@A4]2、PIPER@[Cu2+@A4]的平衡。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

圖4 (A)PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時(shí)域譜;(B)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布; (C)2PIPER@[Cu2+@A4]2的DEER時(shí)域譜; (D)使用PeldorFit(紅線)和MD模擬(灰線)得到的2PIPER@[Cu2+@A4]2距離分布。

(Angew.Chem. Int.Ed. 2021, 60,4939 –4947)

國(guó)儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀

國(guó)儀量子脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100支持電子-電子雙共振技術(shù)，可用于研究復(fù)雜膜蛋白、DNA、RNA、核酸蛋白復(fù)合體以及在各種疾病中產(chǎn)生關(guān)鍵作用的相關(guān)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)定位、功能解釋、生理運(yùn)動(dòng)過(guò)程以及作用機(jī)理解釋。

國(guó)儀量子X(jué)波段脈沖式電子順磁共振波譜儀EPR100

國(guó)儀量子EPR100的DEER實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用DeerAnalysis處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)簽：電子雙共振技術(shù)