Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2 是一款可用于Illumina^®和MGI^®高通量測(cè)序平臺(tái)的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過程，同時(shí)簡(jiǎn)化了操作流程，將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一，極大的降低了建庫的時(shí)間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組等樣本，同時(shí)能兼容FFPE DNA樣本的建庫。在前一代建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了片段化/末修/加A模塊，降低了試劑對(duì)樣本的GC偏好性，提高了末修/加A的效率和試劑的穩(wěn)定性；本試劑盒使用了最新優(yōu)化的連接酶，改善了接頭連接效率。同時(shí)，本試劑盒可搭配Illumina^®或MGI^®的接頭和Primer，用于Illumina^®和MGI^®高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

• 適用100 pg - 1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本
• 高質(zhì)量片段化酶，可隨機(jī)切割雙鏈DNA，酶切片段偏好性低
• 片段化、末端修復(fù)/加A一步完成
• 強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶，顯著提高文庫質(zhì)量及產(chǎn)量
• 適用于FFPE DNA樣本
• 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)		組分名稱	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
			12195ES08		12195ES24	12195ES96
12195-A		Smearase® Buffer 2.0		80 μL	240 μL	960 μL
12195-B		Smearase® Enzyme 2.0		80 μL	240 μL	960 μL
12195-C		Ligation Enhancer 2.0		240 μL	720 μL	3×960 μL
12195-D		Rapid DNA Ligase 2.0		40 μL	120 μL	480 μL
12195-E		Canace® Pro Amplification Mix		200 μL	600 μL	3×800 μL

注：本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺(tái)，如果適配完整接頭，需要額外配置專屬于Illumina^®或者MGI^®的primer mix(Cat#12190 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^®或Cat#12191 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®)。

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-25~-15 °C保存，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為100 pg - 1 μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，建議將DNA稀釋在ddH₂O中進(jìn)行片段化。

3. 對(duì)于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時(shí)間參考表7，本試劑盒片段化偏好性低，耐受各種GC含量的模板。表7為推薦時(shí)間，需客戶在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)，以達(dá)到最佳效果。

4. 為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，片段化反應(yīng)配制過程請(qǐng)于冰上操作。

三、關(guān)于接頭連接 (Adapter Ligation)

1. 針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)，Yeasen可提供如下接頭：

a. Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

b. Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®(Cat#12412~Cat#12413)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

c. Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；

d. Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），試劑盒中的接頭濃度為15 μM。

2.針對(duì)MGI^® 高通量測(cè)序平臺(tái)，Yeasen可提供如下接頭：

a.Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；

b.Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；

c.Hieff NGS^® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI^®，Set 1~Set 4 （Cat#13536 ~ Cat#13539），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；

d.Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 （Cat#13367~Cat#13368)，試劑盒中的接頭濃度為10 μM。

3.Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫產(chǎn)量；使用Adapter時(shí)根據(jù)Input DNA量用TE Buffer進(jìn)行相應(yīng)稀釋。 

表1列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)常規(guī)和UMI Adapter的稀釋方法。

表2列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)常規(guī)Adapter的稀釋方法。

表3列舉了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)的不同Input DNA量推薦的UMI Adapter稀釋方法。

表1  100 pg-1 μg Input DNA針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)推薦的常規(guī)和UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

表2  100 pg-1 μg Input DNA針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)推薦的常規(guī)Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
<1 ng	100倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	50倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	10倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	2倍稀釋	5 μM

表3  100 pg-1 μg Input DNA針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)推薦的UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
5 ng ~ 25 ng	50倍稀釋	0.2 μM
25 ng ~ 100 ng	10倍稀釋	1 μM
100 ng ~ 1000 ng	4倍稀釋	2.5 μM

四、關(guān)于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對(duì)雙輪分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長度分選時(shí)，初始樣品體積應(yīng)盡量≥ 100 μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)

文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表4列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數(shù)。

表4  100 pg-1 μg Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA	1 μg文庫產(chǎn)量推薦PCR循環(huán)數(shù)
1000 ng	2 - 4
500 ng	2 - 4
250 ng	4 - 6
100 ng	5 - 7
50 ng	7 - 9
10 ng	9 - 11
5 ng	10 - 12
1 ng	12 - 15
100 pg	16 - 18

【注】：如果使用了不完整的接頭，需要擴(kuò)增至少2個(gè)循環(huán)，形成完整的接頭。建庫過程中若進(jìn)行片段分選，擴(kuò)增時(shí)請(qǐng)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 文庫濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測(cè)：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測(cè)序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫干擾。

5. 文庫長度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

 

自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：接頭詳細(xì)介紹信息參考上面注意事項(xiàng)中的第三部分“關(guān)于接頭連接”。

4.DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®

5.其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

 

操作流程

圖1 OnePot Pro DNA建庫試劑盒操作流程

 

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

1. 不同片段化時(shí)間得到的插入片段大小

以500 ng 常規(guī)gDNA為模板，使用本試劑盒構(gòu)建文庫，片段化條件分別為37℃ 5/10/ 15/20/30 min，片段化產(chǎn)物1.2×磁珠純化，21 μL ddH₂O洗脫，Qubit測(cè)定濃度后，稀釋至2 ng/μL跑Qsep，回收的插入片段分布如下圖所示。

      圖2 不同片段化時(shí)間酶切片段分布圖

2.不同片段化時(shí)間建庫實(shí)驗(yàn)

以100 ng 常規(guī)gDNA為模板，使用本試劑盒構(gòu)建文庫，片段化條件分別為37℃ 5/10/ 15/20/30 min，PCR擴(kuò)增6個(gè)循環(huán)，最終文庫分布如下圖所示。使用接頭為Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

圖3 不同片段化時(shí)間文庫分布圖

3.不同投入量建庫實(shí)驗(yàn)

以常規(guī)gDNA為模板，投入量從100 pg ~ 1 μg，循環(huán)數(shù)從14 ~ 4個(gè)不等，使用本試劑盒構(gòu)建文庫，統(tǒng)一酶切15 min，100 pg投入量的gDNA建庫產(chǎn)量可達(dá)到600 ng以上，且文庫大小均一如下圖。使用接頭為Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362）。

圖4 不同投入量建庫結(jié)果

4.不同物種建庫實(shí)驗(yàn)

以常見動(dòng)植物樣本gDNA為模板，統(tǒng)一100 ng投入量酶切15 min使用本試劑盒構(gòu)建文庫，在相同的建庫條件下得到的文庫大小均一如下圖。使用接頭為Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

圖5不同物種建庫結(jié)果

5.不同質(zhì)量度的FFPE樣本建庫

本試劑盒可以做到不同質(zhì)量度的FFPE樣本相同酶切時(shí)間，得到的文庫大小一致。一般FFPE樣本酶切15 min可以得到主峰在300 bp左右的文庫，如果要文庫主峰在300 ~ 400 bp，可酶切8 min，然后在連接后進(jìn)行雙輪分選，分選比例為0.65×；0.2×。

以低中高不同質(zhì)量度的FFPE樣本為模板，50 ng投入量使用本試劑盒構(gòu)建文庫，酶切15 min建庫，得到的文庫大小均一如下圖。使用接頭為Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

圖6 不同質(zhì)量度FFPE樣本建庫結(jié)果