【顯微訪談】STELLARIS故事：結(jié)合STED 和Lifetime的優(yōu)勢(shì)

STELLARIS故事：與Alberto Diaspro教授的訪談

我最關(guān)注的一個(gè)特性是白光激光器。其次是STELLARIS系統(tǒng)處理熒光壽命數(shù)據(jù)的能力。這兩個(gè)方面對(duì)我們來(lái)說(shuō)非常重要，因?yàn)槲覀冊(cè)趯?shí)驗(yàn)室中已經(jīng)長(zhǎng)期應(yīng)用壽命數(shù)據(jù)和相位分析。

是的，我認(rèn)為 TauSTED 是實(shí)現(xiàn) STED 技術(shù)的一大進(jìn)步。它不僅鼓勵(lì)人們使用 STED 技術(shù)，還促使他們利用單光子計(jì)數(shù)的優(yōu)勢(shì)。

生物實(shí)驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)是問(wèn)“我想看到什么？”然后是“我需要什么級(jí)別的分辨率來(lái)看到它？”假設(shè)我知道我需要的分辨率低于衍射極限。那么在實(shí)驗(yàn)室里擁有一種能夠使用兩種激光和一個(gè)旋鈕來(lái)選擇特殊分辨率的系統(tǒng)來(lái)回答我的生物學(xué)問(wèn)題，并使用第二種激光和旋鈕實(shí)時(shí)改善空間分辨率，這有多令人興奮？

TauSTED意味著在非常高的分辨率下?lián)碛蟹浅７€(wěn)健的圖像，因?yàn)槟阌蓄~外的數(shù)據(jù)，熒光壽命信息，你正在以巧妙的方式使用這些信息來(lái)重建圖像。20世紀(jì)40年代有一位非常著名的科學(xué)家說(shuō)我們不會(huì)克服衍射極限。衍射就在那里，我們只是添加信息——當(dāng)我們重建圖像時(shí)，我們可以得到更多的細(xì)節(jié)。我們現(xiàn)在可以用TauSTED做的是，以智能的方式添加信息，利用額外的信息來(lái)改善圖像重建。這對(duì)于共聚焦成像、多光子、STED或任何其他對(duì)比機(jī)制都是有效的。

是的。我們選擇 STELLARIS 是因?yàn)榘坠饧す馄鳎╓LL）是一種閉合光譜圈的方式——借助 AOBS，您能夠使用大量光子進(jìn)行光譜檢測(cè)物種。您有非常重要的一點(diǎn)：尊重光子，不丟失光子，以最佳方式使用所有到達(dá)的光子。而且通過(guò)白光激光，我可以在激發(fā)光譜周圍的區(qū)域內(nèi)調(diào)節(jié)激發(fā)。使用 WLL，我還可以在光漂白方面進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)我們處理熒光分子時(shí)，并非總是在激發(fā)光譜的最大值激發(fā)效果最佳。在某些情況下，如果您可以在其他區(qū)域工作，在回答生物學(xué)問(wèn)題和需要減少光漂白時(shí)，這是一個(gè)非常大的優(yōu)勢(shì)。

簡(jiǎn)而言之，對(duì)我們來(lái)說(shuō)擁有 WLL 的主要好處不是可以同時(shí)成像 8 個(gè)熒光信號(hào)。這很棒，但對(duì)我們來(lái)說(shuō)，最大的好處是我在激發(fā)和檢測(cè)方面有調(diào)節(jié)的自由。這作為照明的時(shí)間調(diào)制非常重要。

在培訓(xùn)用戶時(shí)，擁有 WLL 的另一個(gè)重要方面就體現(xiàn)出來(lái)了。在培訓(xùn)新一代顯微鏡專家時(shí)，您需要這樣的系統(tǒng)，因?yàn)槟梢宰杂蛇x擇激發(fā)的波長(zhǎng)并在光譜檢測(cè)范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)。這具有巨大的價(jià)值，因?yàn)樗兄谒麄冋嬲_(kāi)始理解熒光的情況。

還有一個(gè)方面我覺(jué)得很有吸引力：新的探測(cè)器系列。當(dāng)你擁有能夠進(jìn)行單光子計(jì)數(shù)的探測(cè)器，并且你需要它們來(lái)處理壽命問(wèn)題時(shí)，這就意味著在飽和度方面不再有問(wèn)題。這對(duì)生命科學(xué)研究非常重要，對(duì)我在材料科學(xué)方面的項(xiàng)目也是如此。

總的來(lái)說(shuō)，這是共聚焦技術(shù)的一個(gè)真正的巨大飛躍。分辨率佳。通過(guò)使用熒光面板向系統(tǒng)發(fā)出指令的方式，確實(shí)有助于了解自己在做什么。光學(xué)切片也非常好。當(dāng)你需要一定的空間分辨率時(shí)，取樣的方式也很好。這些天，我對(duì)我遇到的所有人說(shuō)，這是我職業(yè)生涯中使用過(guò)的非常好的商用共聚焦系統(tǒng)。

但對(duì)我來(lái)說(shuō)，最好的是你們顯示與壽命有關(guān)的數(shù)據(jù)的方式。長(zhǎng)期以來(lái)，我們一直使用相位法來(lái)瀏覽熒光圖像并了解發(fā)生了什么。當(dāng)你在超分辨率下進(jìn)行此項(xiàng)工作時(shí)，這是一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì)。

可對(duì)激發(fā)進(jìn)行調(diào)整，有助于為樣品添加最佳制備。您可以同時(shí)進(jìn)行光譜分析和顯微分析。用戶可以真正優(yōu)化使用該系統(tǒng)收集的數(shù)據(jù)種類。然后再切換到 STED，這真是太棒了。STED 并不意味著只具有超分辨率，而是意味著可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)旋鈕，自由瀏覽到您感興趣的特殊分辨率，直到找到您想看的東西。這非常令人興奮。我必須承認(rèn)，當(dāng)您使用STELLARIS工作時(shí)，您很難離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。你會(huì)開(kāi)始探索該系統(tǒng)的所有潛力，而不會(huì)意識(shí)到時(shí)間的流逝！

他們可以開(kāi)始思考在特定波長(zhǎng)激發(fā)的意義。在開(kāi)始采集一系列圖像（例如30或50張幻燈片）之前，他們可以先進(jìn)行光譜分析。如果一開(kāi)始，他們有機(jī)會(huì)通過(guò)調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng)和光譜窗口來(lái)了解發(fā)生了什么，而不是僅僅開(kāi)始采集數(shù)據(jù)，那么他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將會(huì)更優(yōu)化。這讓他們理解激發(fā)熒光分子意味著什么。首先，他們會(huì)遵循系統(tǒng)在設(shè)置中選擇熒光團(tuán)時(shí)給出的建議。但是，能夠操縱激發(fā)和檢測(cè)光譜，在不同波長(zhǎng)之間滑動(dòng)，可以讓他們親身體驗(yàn)信息，而不是簡(jiǎn)單地信任它。一個(gè)很好的例子是：許多研究人員認(rèn)為激發(fā)熒光素的最佳波長(zhǎng)是488納米，因?yàn)樵谄渌褂脝尉€激光器的系統(tǒng)中，這是他們能使用的最佳波長(zhǎng)。但如果你能調(diào)節(jié)波長(zhǎng)，跟蹤真實(shí)的激發(fā)光譜，你就能看到這個(gè)光譜在樣品條件下會(huì)發(fā)生變化，這樣你就能真正看到激發(fā)和發(fā)射的肩峰。當(dāng)你進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)，能夠去除不需要的信號(hào)。這不僅對(duì)培訓(xùn)有好處，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有益！

當(dāng)你處理一個(gè)固定的樣本時(shí)，不是說(shuō)一切都能很好地運(yùn)作，但大致上都能正常工作。然而，當(dāng)你處理一個(gè)活體樣本時(shí)，你可能需要改變當(dāng)前的條件，以便更好地觀察發(fā)生了什么。然后，我們有你操作時(shí)的定量信息，比如功率，激發(fā)體積……你擁有所有這些數(shù)據(jù)，再加上可調(diào)性。這就是你能夠在你面前優(yōu)化活細(xì)胞成像的能力。

這有點(diǎn)像是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新世界。最初，理解如何處理這些數(shù)據(jù)可能看起來(lái)有點(diǎn)令人畏懼。獲取壽命信息意味著什么？但當(dāng)他們開(kāi)始使用它時(shí)，他們意識(shí)到這確實(shí)是一種額外的價(jià)值，能夠利用壽命信息來(lái)區(qū)分不同的熒光物種，并更深入地理解自熒光現(xiàn)象。

使用白光激光，您可以更好地控制您的實(shí)驗(yàn)，但您需要對(duì)您要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)有更多的了解。您要在實(shí)驗(yàn)中加入光譜學(xué)，您需要決定將激發(fā)光譜置于何處，以優(yōu)化您的試樣。對(duì)于不太熟悉顯微鏡的研究人員來(lái)說(shuō)，這可能令人害怕，但它能幫助他們了解如何以最佳方式優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，從而避免光漂白等現(xiàn)象，真正從樣本中獲得最佳信號(hào)。進(jìn)行科學(xué)研究，而不僅僅是成像。

這種 WLL 很容易調(diào)整。對(duì)我們來(lái)說(shuō)，最大的愿望就是能利用 WLL 獲得壽命數(shù)據(jù)，現(xiàn)在我們已經(jīng)做到了。我們還想進(jìn)行 FRET 實(shí)驗(yàn)，因?yàn)?WLL 非常適合這種實(shí)驗(yàn)。您可以以任何方式進(jìn)行 FRET：光譜偏移、壽命，而且不會(huì)因?yàn)槭芟抻诠潭úㄩL(zhǎng)而對(duì)受體或供體造成不必要的光漂白。現(xiàn)在，您可以選擇最佳波長(zhǎng)，而不會(huì)破壞實(shí)驗(yàn)。

“如今，我認(rèn)為這是我在實(shí)驗(yàn)室里用過(guò)非常棒的顯微鏡?！?/strong>

—— Alberto Diaspro教授

是的，我們有研究人員對(duì)此感興趣。主要是因?yàn)?strong>標(biāo)記效率和實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間的考量。當(dāng)你向紅外光譜區(qū)域移動(dòng)時(shí)，你可以進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，特別是那些對(duì)胚胎和斑馬魚(yú)、厚的活體樣本感興趣的研究人員，肯定能從紅光擴(kuò)展中獲益。如果你需要進(jìn)行深層成像，向紅光區(qū)域發(fā)展總是最佳選擇。

讓我告訴你，我們從Leica Microsystems團(tuán)隊(duì)那里得到了很好的技術(shù)支持。無(wú)論何時(shí)我們聯(lián)系，總能在極短的時(shí)間內(nèi)得到答復(fù)——理解問(wèn)題所在并提供解決方案，迅速解決問(wèn)題。這對(duì)我們來(lái)說(shuō)非常重要，因?yàn)槲覀兊南到y(tǒng)總是被預(yù)約得滿滿的。對(duì)我來(lái)說(shuō)，Leica Microsystems的技術(shù)服務(wù)是意大利數(shù)一數(shù)二的。當(dāng)你在自己的實(shí)驗(yàn)室中獲得商業(yè)系統(tǒng)，用于個(gè)人研究并在機(jī)構(gòu)設(shè)施中共享時(shí)，優(yōu)質(zhì)的服務(wù)確實(shí)能帶來(lái)巨大的差異。